Vecteurs viraux et transfert de gènes
Présentation
La plateforme VVTG est une plateforme de l’Université Paris Cité, située sur la Faculté de Santé du site de Necker.
Nous réalisons historiquement des prestations de productions virales à façon pour les chercheurs des laboratoires de recherche académiques Français.
La plateforme est labellisée « IBISA » depuis le 8 décembre 2022, grâce à la qualité de ses prestations et les nombreux développements qu’elle a su mettre en place depuis sa création en 2009.
L'offre de virus recombinants de Transfert de Gène concerne la production de Lentivirus, de Rétrovirus et d’Adénovirus, de grade recherche, défectifs pour la réplication.
Les vecteurs viraux ont la capacité de transférer du matériel génétique dans les cellules cibles infectées. Ces outils performants et spécifiques permettent ainsi de moduler l’expression de gènes à l’aide de séquences génétiques pour la surexpression ou la répression (shRNA, miRNA) de gènes, mais aussi par l’introduction de modifications dans le génome des cellules infectées à l’aide de ciseaux moléculaires (système CRISPR-CAS-9). Ces vecteurs viraux de transfert de gènes apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires cellulaires. Ils sont une aide précieuse dans la recherche de traitements pour les maladies, notamment par la voie de la thérapie génique.
Le personnel de la plateforme VVTG, constitué de quatre personnes, réalise avec expertise l'ensemble des prestations de production et de titration des virus de classe 2, en L2, en proposant :
1) des types viraux multiples, pouvant couvrir de nombreuses applications de transfert de gènes, in vitro et in vivo,
2) des conditionnements de production adaptés aux applications de transfert de gènes de grade recherche,
3) des contrôles qualité, par des productions virales tests et des contrôles cellulaires,
5) des outils viraux type (GFP, CRE, ß-gal, GFP‐CRE) pour différents virus.
La plateforme VVTG propose également depuis 2018 et 2021, un service d’immortalisation de lymphocytes B (LB) humains et T (LT) humains à l’aide des virus EBV et Saïmiri.
L’immortalisation des LB et LT peut être réalisée à partir d’un même échantillon de sang humain ou murin. Cette prestation est adaptée aux recherches sur les maladies rares affectant le système immunitaire.
IMPORTANT : nous contacter en amont de vos projets pour que nous puissions évaluer votre besoin et vous transmettre les informations, documents et méthodologies nécessaires à la mise en place de vos prestations.
Localisation
Plateforme vecteurs viraux et transfert de gènes (VVTG)
SFR Necker Inserm US24 CNRS UAR3633
Université Paris Cité,
Faculté Santé UFR Médecine
156-160 rue de Vaugirard
75015 Paris
Tél : 01 40 61 54 54 ou 40 61 54 57
Contact général de la plateforme et prestations de virus de transfert de gènes : sylvie.fabrega@inserm.fr
Contact immortalisation de lymphocytes B et T :
Personnel
Laure Nay
IA-Université Paris Cité
Alicia Fernandes
AI-Inserm
Redouane Si-bouazza
IA-Université Paris Cité
Équipements
La plateforme VVTG dispose de locaux confinés L1, L2 et L3 dédiés à ses activités.
Un local L2 est réservé à la production d’OGM viraux de groupe 2 de classe 2 avec inserts de type A, à la culture de cellules humaines primaires et de lignées cellulaires par le personnel de la plateforme. Ce L2 est entièrement équipé pour les activités qui y sont menées.
Plateforme VVTG L2
Le « L3 SFR Necker » est un local confiné BCL3 aux normes, mis en place et géré par la plateforme VVTG au sein de la SFR Necker.
Il représente une nouvelle plateforme technique ouverte aux travaux des équipes de recherche académiques mettant en jeux des microorganismes de classe 3 et leurs OGM.
Ce L3 de 83 m2, dont 52 m2 de pièces de travail, ouvrira fin 2023.
Responsable du L3 : sylvie.fabrega@inserm.fr
IMPORTANT : contacter dès que possible la responsable du L3 pour anticiper tout projet d’activité sur des microorganismes de classe 3, ainsi que toute production d’OGM viraux de transfert de gènes de classe 3 par le personnel de la plateforme.
NB : pour les virus recombinants produits en L3, un déclassement d’utilisation est autorisé en L2.
Toute activité nécessitera que les utilisateurs disposent d’une autorisation OGM de classe 3 à jour pour leur projet en L3.
Prestations
Expertises et services de productions de virus de transfert de gènes
La plateforme apporte des conseils sur :
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Les vecteurs viraux, les vecteurs d’expression,
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Le classement des inserts ADN en catégorie A ou B, selon leur dangerosité,
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Les conditionnements de production,
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Les modalités de productions des virus,
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Les modalités d’infections,
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La règlementation OGM, démarche agrément d’installation et autorisation OGM,
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Les modalités de manipulation des virus de transfert de gènes en L2 et L3,
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Le transport règlementé des OGM,
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L’immortalisation de cellules lymphoïdes B et T.
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IMORTANT : respect de la règlementation OGM de classe 1, 2 et 3
La plateforme VVTG dispose de son propre agrément OGM de groupe II, classe 2 pour réaliser les productions virales en L2 pour ses propres vecteurs.
Tout utilisateur client de la plateforme VVTG devra disposer d’une autorisation OGM de son projet à jour pour pouvoir utiliser les OGM viraux de classe 2 et 3, produits par la plateforme.
Il en est de même pour sa déclaration d’OGM de classe 1.
Affin de s’assurer du respect de la règlementation sur les OGM viraux, la plateforme VVTG enregistre :
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Les caractéristiques des vecteurs viraux à produire (informations du tableau des associations),
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Le numéro d’autorisation du projet OGM (classe 2 et 3) du laboratoire de l’utilisateur
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La date d’obtention de l’autorisation.
Pour tout information OGM : sylvie.fabrega@inserm.fr
Production et amplification de virus OGM de classe 2 en L2 :
I - LENTIVIRUS ET RETROVIRUS
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Lentivirus ΔU3 SIN de troisième génération, enveloppe VSV‐G
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Rétrovirus MLV, enveloppe VSV‐G (Ecotrope en demande spécifique)
Les particules virales sont obtenues dans des cellules de production HEK-293T, par la co-transfection d’un vecteur d’expression viral (lentiviral ou rétroviral) contenant les séquences à exprimer (inserts) en présence de vecteurs de trans-complémentation apportant le matériel viral complémentaire, nécessaire à l’obtention des particules virales. Le pseudotypage des virus est réalisé à l’aide de l’enveloppe pantropique VSV-G.
Les virus collectés dans le milieu de culture sont filtrés, puis concentrés par ultracentrifugation, et conservés en aliquotes à - 80°C.
L’infections de cellules humaines HCT116 ou murines NIH3T3 (rétrovirus uniquement) par différentes dilutions des virus produits, permet le dosage des virus (titration). Leur présence dans le génome cellulaire est détectée soit par l’expression de fluorophores (analyse par FACS), soit par la sélection d’un gène de résistance à l’aide de drogues (puromycine, blasticidine, hygromycine) ou par la détection de séquences pro-virales (analyse Q-PCR).
Le processus de production-titration des Lentivirus et des Rétrovirus est d’environ 15 jours.
Conditionnement de production, volume et titres viraux livrés – nous contacter pour plus de précisions
La qualité́ des cellules de production est régulièrement analysée.
La qualité́ des virus produits est vérifiée par le titre viral de vecteurs lentiviraux et rétroviraux tests.
II - ADENOVIRUS sérotype 5, ΔE1 / ΔE3
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Amplifications successives de particules adénovirales existantes,
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Obtention de nouvelles particules virales par la transfection du vecteur d’expression adénoviral linéarisé (40 kb) dans des cellules de production, puis amplifications successives du virus. Technique kit AdEasy.
Les particules virales amplifiées sont purifiées par une double ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium, dessalées sur colonne puis conservés en aliquots à - 80°C.
Les particules virales infectieuses sont dosées par l’infection de cellules HEK 293A selon la technique des plages de lyses.
Le processus de production et titration de particules adénovirales existantes dure environ 45 jours.
Conditionnement de production, volume et titres viraux livrés – nous contacter
EXPERTISES ET SERVICES D’IMMORTALISATION DE LYMPHOCYTES B ET T
À partir d’échantillons sanguins :
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Isolement des lymphocytes sur gradient de Ficoll,
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Sélection de la prolifération des lymphocytes B ou T,
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Immortalisation à l’aide des virus EBV (LB) ou HVS (LT),
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Amplification des lignées, congélation d’ampoules de lignées établies,
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Livraison des cultures de lymphocytes immortalisés.
Produits livrés :
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lignées B-EBV ou T-HVS immortalisées en culture (flacon T25)
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ampoules de lignée B-EBV ou T-HVS (3 ampoules)
Pour le respect de la règlementation, la plateforme VVTG enregistre :
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Les caractéristiques des échantillons à traiter,
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La copie du consentement du patient,
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L’autorisation d’activité sur des échantillons biologiques humains de l’investigateur.
IMPORTANT : les échantillons sanguins et cellulaires reçus par la plateforme devront être anonymisés en amont.
Publications
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Co-Transplantation of Barcoded Lymphoid-Primed Multipotent (LMPP) and Common Lymphocyte (CLP) Progenitors Reveals a Major Contribution of LMPP to the Lymphoid Lineage. Michaels V, Chalabi S, Legrand A, Renard J, Tejerina E, Daouya M, Fabrega S, Megret J, Olaso R, Boland A, Deleuze JF, Battail C, Tronik-Le Roux D, Ezine S. Int J Mol Sci. 2023 Feb 22;24(5):4368. doi: 10.3390/ijms24054368. PMID: 36901798
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Glioblastoma cell motility depends on enhanced oxidative stress coupled with mobilization of a sulfurtransferase. Saurty-Seerunghen MS, Daubon T, Bellenger L, Delaunay V, Castro G, Guyon J, Rezk A, Fabrega S, Idbaih A, Almairac F, Burel-Vandenbos F, Turchi L, Duplus E, Virolle T, Peyrin JM, Antoniewski C, Chneiweiss H, El-Habr EA, Junier MP. Cell Death Dis. 2022 Oct 30;13(10):913. doi: 10.1038/s41419-022-05358-8. PMID: 36310164
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MiR-324-5p and miR-30c-2-3p Alter Renal Mineralocorticoid Receptor Signaling under Hypertonicity Vu TA, Ingrid Lema, Imene Hani, Lydie Cheval, Laura Atger-Lallier, Vilayvane Souvannarath, Julie Perrot, Mélanie Souvanheuane, Yannick Marie, Sylvie Fabrega, Anne Blanchard, Jérôme Bouligand, Peter Kamenickỷ, Gilles Crambert, Laetitia Martinerie, Marc Lombès and Say Viengchareun.. Cells 2022, 11, x. doi: 10.3390/cells11091377.
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Machine learning-driven identification of drugs inhibiting cytochrome P450 2C9.Elodie Goldwaser, Catherine Laurent, Nathalie Lagarde, Sylvie Fabrega, Laure Nay , Bruno O Villoutreix , Christian Jelsch , Arnaud B Nicot , Marie-Anne Loriot , Maria A Miteva. PLoS Comput Biol. 2022 Jan 26;18(1):e1009820., doi: 10.1371/journal.pcbi.1009820.
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Combination of lentiviral and genome editing technologies for the treatment of sickle cell disease. Ramadier S, Chalumeau A, Felix T, Othman N, Aknoun S, Casini A, Maule G, Masson C, De Cian A, Frati G, Brusson M, Concordet JP, Cavazzana M, Cereseto A, El Nemer W, Amendola M, Wattellier B, Meneghini V, Miccio A. Mol Ther. 2022 Jan 5;30(1):145-163. doi: 10.1016/j.ymthe.2021.08.019. Epub 2021 Aug 19.PMID: 34418541
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Biallelic mutations in the SARS2 gene presenting as congenital sideroblastic anemia Elia Colin, Geneviève Courtois, Chantal Brouzes, Juliette Pulman, Marion Rabant, Agnès Rötig, Hélène Taffin, Mathilde Lion-Lambert, Sylvie Fabrega, Lydie Da Costa, Mariane De Montalembert, Rémi Salomon, Olivier Hermine and Lucile Couronné. Haematologica 2021, 106
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Pharmacological Premature Termination Codon Readthrough of ABCB11 in Bile Salt Export Pump Deficiency: An In Vitro Study. Amzal R, Thébaut A, Lapalus M, Almes M, Grosse B, Mareux E, Collado-Hilly M, Davit-Spraul A, Bidou L, Namy O, Jacquemin E, Gonzales E. Hepatology. 2021 Apr;73(4):1449-1463. doi: 10.1002/hep.31476. PMID: 32702170
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Functional rescue of an ABCB11 mutant by ivacaftor: A new targeted pharmacotherapy approach in bile salt export pump deficiency Mareux E, Lapalus M, Amzal R, Almes M, Aït-Slimane T, Delaunay JL, Adnot P, Collado-Hilly M, Davit-Spraul A, Falguières T, Callebaut I, Gonzales E, Jacquemin E. Liver Int. 2020 Aug;40(8):1917-1925. doi: 10.1111/liv.14518. Epub 2020 Jun 8. PMID: 32433800.
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The role of MHC class I recycling and Arf6 in cross-presentation by murine dendritic cells. Montealegre S, Abramova A, Manceau V, de Kanter AF, van Endert P. Life Sci Alliance. 2019 Nov 18;2(6):e201900464. DOI: 10.26508/lsa.201900464
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High-throughput screening identifies suppressors of mitochondrial fragmentation in OPA1 fibroblasts. Emma Cretin, Priscilla Lopes, Elodie Vimont, Takashi Tatsuta, Thomas Langer, Anastasia Gazi, Martin Sachse, Patrick Yu-Wai-Man, Pascal Reynier, Timothy Wai. EMBO Mol Med (2021) e13579 https://doi.org/10.15252/emmm.202013579
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The tetraspanin CD9 controls migration and proliferation of parietal epithelial cells and glomerular disease progression. Hélène Lazareth, Carole Henique, Olivia Lenoir, Victor G. Puelles, Martin Flamant, Guillaume Bollée, Cécile Fligny, Marine Camus, Lea Guyonnet, Corinne Millien, François Gaillard, Anna Chipont, Blaise Robin, Sylvie Fabrega, Neeraj Dhaun, Eric Camerer, Oliver Kretz, Florian Grahammer, Fabian Braun, Tobias B. Huber, Dominique Nochy, Chantal Mandet, Patrick Bruneval, Laurent Mesnard, Eric Thervet, Alexandre Karras, François Le Naou, Eric Rubinstein, Claude Boucheix, Antigoni Alexandrou, Marcus J. Moeller, Cédric Bouzigues & Pierre-Louis Tharaux. Nature Communications (2019) 10:3303 https://doi.org/10.1038/s41467-019-11013-2
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Persistence of Integrase-Deficient Lentiviral Vectors Correlates with the Induction of STING-Independent CD8+ T Cell Responses. Celine Cousin, Marine Oberkampf, Tristan Felix, Pierre Rosenbaum, Robert Weil, Sylvie Fabrega, Valeria Morante, Donatella Negri, Andrea Cara, Gilles Dadaglio and Claude Leclerc Cell Reports 2019 : 26, 1242–1257. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.01.025.
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Changes in chromatin state reveal ARNT2 at a node of a tumorigenic transcription factor signature driving glioblastoma cell aggressiveness. Alexandra Bogeas · Ghislaine Morvan‑Dubois · Elias A. El‑Habr1· François‑Xavier Lejeune · Matthieu Defrance ·Ashwin Narayanan · Klaudia Kuranda · Fanny Burel‑Vandenbos· Salwa Sayd · Virgile Delaunay·Luiz G. Dubois · Hugues Parrinell7· Stéphanie Rialle · Sylvie Fabrega · Ahmed Idbaih · Jacques Haiech ·Ivan Bièche · Thierry Virolle · Michele Goodhardt · Hervé Chneiweiss · Marie‑Pierre Junier. Acta Neuropathologica February 2018, Volume 135, Issue 2, pp 267–283 https://doi.org/10.1007/s00401-017-1783-x
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ZRF1 is a novel S6 kinase substrate that drives the senescence programme. Manuela Barilari, Gregory Bonfils, Caroline Treins, Vonda Koka, Delphine De Villeneuve, Sylvie Fabrega & Mario Pende. The EMBO Journal Mar 15;36(6):736-750. 2017. DOI: 10.15252/embj.201694