Vecteurs viraux et transfert de gènes
Présentation
La plateforme VVTG est une plateforme de l'Université Paris Cité, située sur le site de la Faculté Necker, qui réalise des productions virales à façon pour les chercheurs de ses laboratoires. Elle est également ouverte aux équipes académiques nationales dans le cadre de l'encouragement à l'émergence GIS-IBISA qu'elle a obtenu lors de sa création en 2009.
L'offre de virus recombinants de transfert de gènes concerne la production de Lentivirus, de Rétrovirus et d'Adénovirus, de grade recherche et défectifs pour la réplication.
Le personnel de la plateforme VVTG réalise avec expertise l'ensemble des prestations de production et de titrage des virus en proposant : 1) des types viraux diversifiés pouvant couvrir de nombreuses applications de transfert de gènes, 2) des conditionnements de production adaptés aux applications de transfert de gènes in vitro ou in vivo, 3) des contrôles de qualité, 4) des productions virales tests, 5) des outils viraux de type (GFP, CRE, ß-gal, GFP‐CRE).
Les vecteurs viraux ont la capacité de transmission du matériel génétique dans les cellules cibles infectées. Ces outils performants et spécifiques permettent ainsi de moduler l'expression de gènes à l'aide de séquences génétiques pour la surexpression ou la répression (shRNA, miRNA) de gènes, mais aussi par l'introduction de modifications dans le génome des cellules infectées à l'aide de ciseaux moléculaires (système CRISPR-CAS-9). Ces vecteurs viraux de transfert de gènes apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires cellulaires. Ils sont une aide précieuse dans la recherche de traitements pour les maladies, notamment par la voie de la thérapie génique.
La plateforme VVTG propose également un service d'immortalisation de lymphocytes B (LB) humains et T (LT) humains à l'aide des virus EBV et Saïmiri. L'immortalisation des LB et LT peut être réalisée à partir d'un même échantillon sanguin de patient. Cette prestation est essentielle pour les recherches sur les cellules immunitaires et notamment sur les maladies rares affectant le système immunitaire.
Localisation
Plateforme vecteurs viraux et transfert de gènes (VVTG)
SFR Necker Inserm US24 CNRS UAR3633
Université Paris Cité,
Faculté Santé UFR Médecine
156-160 rue de Vaugirard
75015 Paris
Tél : 01 40 61 54 54 ou 40 61 54 57
Contact : sylvie.fabrega@inserm.fr
Contact immortalisation de lymphocytes B et T :
La plateforme VVTG est située au premier étage du bâtiment Faculté de Santé
Personnel
Laure Nay
IA-Université Paris Cité
Alicia Fernandes
AI-Inserm
Redouane Si-bouazza
IA-Université Paris Cité
Équipements
La plateforme VVTG dispose de locaux confinés L1, L2 et L3 dédiés à ses activités. Un local L2 est réservé à la production d'OGM viraux de groupe 2 de classe 2 avec inserts de type A, à la culture de cellules humaines primaires et de lignées cellulaires. Ce L2 est entièrement équipé pour ces activités.
La plateforme VVTG gère l'ouverture prochaine, été 2022, de son plateau technique L3, qui sera accessible à tout utilisateur de l'Université Paris Cité ayant des expérimentations sur des OGM de classe 3, mais aussi sur des microorganismes responsables de groupe 3, tels que le virus HIV-1 et le Sras-Cov-2. La plateforme y réalisera ses propres productions d'OGM viraux avec inserts de type B, ainsi que des immortalisations cellulaires.
Plateforme VVTG L2
Prestations
Expertises et services de productions de virus de transfert de gènes
La plateforme apporte des conseils sur :
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Les vecteurs viraux, les vecteurs d'expression,
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Le classement des inserts ADN en catégorie A ou B, selon leur dangerosité,
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Les conditionnements de production,
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Les modalités de productions des virus,
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Les modalités d'infections,
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La règlementation OGM,
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Les modalités de manipulation des virus en L2,
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Le transport des OGM
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L'immortalisation des cellules B et T.
Production et amplification de virus OGM de classe 2 en L2 :
I - LENTIVIRUS ET RÉTROVIRUS
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Lentivirus ΔU3 SIN de troisième génération, enveloppe VSV‐G
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Rétrovirus MLV, enveloppes VSV‐G ou Ecotrope
Les particules virales sont trouvées dans des cellules de production HEK-293T, par la co-transfection d'un vecteur d'expression viral (lentiviral ou rétroviral) contenant les séquences à exprimer (inserts) avec des vecteurs de trans-complémentation contenant le matériel viral complémentaire nécessaire à l'obtention des particules virales. Le pseudotypage des virus est réalisé à l'aide de l'enveloppe pantropique VSV-G.
Les virus collectés dans le milieu de culture sont filtrés, concentrés par ultracentrifugation, conservés en aliquotes à - 80°C. L'infections de cellules humaines HCT116 ou murines NIH3T3 par différentes dilutions virales permet le dosage des virus dont la présence dans le génome cellulaire est détectée soit par l'expression de fluorophores (analyse FACS), soit par la sélection d'un gène de résistance à l'aide de drogues (puromycine, blasticidine, hygromycine) ou par la détection de séquences pro-virales (analyse Q-PCR).
Le processus de production-titration est d'environ 15 jours.
Conditionnement de production, volume et titres viraux livrés – nous contacter
La qualité́ des cellules de production est régulièrement testée.
La qualité des produits antivirus est vérifiée par le titre viral de vecteurs lentiviraux et rétroviraux tests.
La plateforme VVTG dispose de son propre agrément OGM de groupe II, classe 2 pour réaliser les productions virales en L2. Pour le respect de la règlementation sur les viraux OGM, la plateforme VVTG enregistre les caractéristiques des vecteurs à produire. Tout utilisateur aura son agrément OGM à jour pour utiliser les produits OGM.
II - ADÉNOVIRUS sérotype 5, E1 / ΔE3
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Amplifications successives de particules adénovirales existantes,
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Obtention de nouvelles particules virales par la transfection du vecteur d'expression adénoviral linéarisé (40 ko) dans des cellules de production, puis amplifications successives du virus. Kit technique AdEasy.
Les particules virales amplifiées sont purifiées par une double ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium, dessalées sur colonne puis conservées en aliquotes à - 80°C.
Les particules virales infectieuses sont dosées par l'infection de cellules HEK 293A selon la technique des plages de lyses.
Le processus de production-titration est d'environ 45 jours.
Conditionnement de production, volume et titres viraux livrés – nous contacter.
EXPERTISES ET SERVICES D'IMMORTALISATION DE LYMPHOCYTES B ET T
À partir de sang : isolement des lymphocytes sur gradient de Ficoll, sélection des lymphocytes B ou T, immortalisation à l'aide des virus EBV (LB) ou HVS (LT), amplification des lignées, congélation d'ampoules de lignées établies et livraison de cultures de lymphocytes immortalisés.
Produits livrés :
• lignées B-EBV ou T-HVS immortalisées en culture (flacon T25)
• ampoules de lymphocytes
• ampoules de lignée B-EBV ou T-HVS (3 ampoules)
Pour le respect de la règlementation, la plateforme VVTG enregistre les caractéristiques des échantillons à traiter, demande une copie du consentement du patient et que l'investigateur ait son autorisation d'activité sur des échantillons biologiques humains.
Publications
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Le rôle du recyclage du CMH de classe I et de l'Arf6 dans la présentation croisée par les cellules dendritiques murines. Montealegre S, Abramova A, Manceau V, de Kanter AF, van Endert P. Life Sci Alliance. 18 novembre 2019; 2 (6) : e201900464. DOI : 10.26508/lsa.201900464
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Le criblage à haut débit identifie les suppresseurs de la fragmentation mitochondriale dans les fibroblastes OPA1. Emma Cretin, Priscilla Lopes, Elodie Vimont, Takashi Tatsuta, Thomas Langer, Anastasia Gazi, Martin Sachse, Patrick Yu-Wai-Man, Pascal Reynier, Timothy Wai. EMBO Mol Med (2021) e13579 https://doi.org/10.15252/emmm.202013579
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La tétraspanine CD9 contrôle la migration et la prolifération des cellules épithéliales pariétales et la progression de la maladie glomérulaire. Hélène Lazareth, Carole Henique, Olivia Lenoir, Victor G. Puelles, Martin Flamant, Guillaume Bollée, Cécile Fligny, Marine Camus, Léa Guyonnet, Corinne Millien, François Gaillard, Anna Chipont, Blaise Robin, Sylvie Fabrega, Neeraj Dhaun, Eric Camerer, Oliver Kretz, Florian Grahammer, Fabian Braun, Tobias B. Huber, Dominique Nochy, Chantal Mandet, Patrick Bruneval, Laurent Mesnard, Eric Thervet, Alexandre Karras, François Le Naou, Eric Rubinstein, Claude Boucheix, Antigoni Alexandrou, Marcus J. Moeller, Cédric Bouzigues & Pierre-Louis Tharaux. La nature Communication (2019) 10:3303 https://doi.org/10.1038/s41467-019-11013-2
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La persistance des vecteurs lentiviraux déficients en intégrase est en corrélation avec l'induction de réponses des cellules T CD8+ indépendantes de STING. Céline Cousin, Marine Oberkampf, Tristan Felix, Pierre Rosenbaum, Robert Weil, Sylvie Fabrega, Valeria Morante, Donatella Negri, Andrea Cara, Gilles Dadaglio et Claude Leclerc Cell Reports 2019 : 26, 1242–1257. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.01.025 .
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Les changements dans l'état de la chromatine révèlent ARNT2 à un nœud d'une signature de facteur de transcription tumorigène entraînant l'agressivité des cellules du glioblastome. Alexandra Bogeas · Ghislaine Morvan‑Dubois · Elias A. El‑Habr1· François‑Xavier Lejeune · Matthieu Defrance ·Ashwin Narayanan · Klaudia Kuranda · Fanny Burel‑Vandenbos· Salwa Sayd · Virgile Delaunay·Luiz G. Dubois · Hugues Parrinell7· Stéphanie Rial · Sylvie Fabrega · Ahmed Idbaih · Jacques Haiech ·Ivan Bièche · Thierry Virolle · Michèle Goodhardt · Hervé Chneiweiss · Marie‑Pierre Junier. Acta Neuropathologica Février 2018, Volume 135, Numéro 2 , pp 267-283 https://doi.org/10.1007/s00401-017-1783-x
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ZRF1 est un nouveau substrat de kinase S6 qui pilote le programme de sénescence. Manuela Barilari, Grégory Bonfils, Caroline Treins, Vonda Koka, Delphine De Villeneuve, Sylvie Fabrega & Mario Pende. Le Journal de l'EMBO 15 mars;36(6):736-750. 2017. DOI : 10.15252/embj.201694